Immunhistologie

Grundlagen

Die Immunhistologie ist eine der zentralen Methoden der modernen histopathologischen Diagnostik und Forschung. Durch immunhistologische Techniken wird es möglich, Proteine, Polysaccharide u.a. Strukturen, gegen die Antikörper gebildet werden können, hochspezifisch nachzuweisen. Aus Körperflüssigkeiten oder in vitro gewonnen, lassen sich diese Antikörper in verschiedenen Untersuchungsverfahren als “molekulare Pinzetten” zum Nachweis der von ihnen spezifisch erkannten Antigene einsetzen. Dadurch kann die konventionell-histologische Analyse von Differenzierungsmustern um die Ermittlung von Expressionsmustern ergänzt werden. Sehr anschauliche Beispiele für den Nutzen dieser Methode bietet die Metastasenpathologie, bei der die immunhistologische Ermittlung charakteristischer Expressionsmuster von Leber-, Lungen oder Lymphknotenmetastasen u.U. entscheidende Hinweise auf die Primärlokalisation des Tumors liefern kann.

Die Bildung von Antikörpern ist die zentrale Funktion der humoralen Immunität, mit der der Organismus sich gegen eingedrungene Fremdsubstanzen zur Wehr setzen kann.

Substanzen, die im Organismus eine Immunreaktion hervorrufen können, werden als Antigen bezeichnet (Proteine, Oligopeptide, Polysaccharide, Lipide). Die molekularen Strukturen eines Antigens, die von einem Antikörper erkannt werden können, werden als antigene Determinanten oder Epitope bezeichnet.
Als Antigenität einer Substanz wird ihre Fähigkeit bezeichnet, prinzipiell eine Immunantwort induzieren zu können. Die Spezifität eines Antigens ergibt sich aus der Anzahl seiner verschiedenen Epitope. Enthält das Antigen genügend Determinanten, um selbst eine Immunantwort hervorzurufen, so wird es als Vollantigen bezeichnet. Viele kleine Moleküle provozieren erst nach Kopplung an einen hochmolekularen Träger eine Immunantwort; solche Verbindungen werden als Haptene bezeichnet.

Die Immunogenität, also die Fähigkeit eines Antigens, tatsächlich eine Immunreaktion auszulösen, hängt von mehreren Faktoren ab. Dazu zählen neben den physikochemischen Eigenschaften des Antigens auch Eigenschaften des jeweiligen Empfängerorganismus. Diese EIgenschaften können zwischen verschiedenen Tierspezies und einzelnen Individuen stark differieren. Eine wichtige Rolle spielt auch die Dosis und die Verabreichungsform des Antigens sowie dessen Verweildauer im Empfänger.

Bau und Eigenschaften von Antikörpern

Antikörper zählen zur Proteinfamilie der Immunglobuline. Sie sind in der Gamma-Globulinfraktion des Blutserums enthalten, die so nach ihren Wanderungseigenschaften in der Serumelektrophorese benannt wurden.

Immunglobuline werden im Rahmen der humoralen Immunantwort von Plasmazellen. Sie werden hinsichtlich Größe, Molekulargewicht, Struktur und Funktion in 5 Klassen eingeteilt:

Immunglobulin G (IgG), IgA, IgM, IgD, IgE
(geordnet nach abnehmender Quantität im Plasma)

Antikörper-Präparationen, die für die immunhistologischen Färbungen eingesetzt werden, enthalten vorwiegend Ak der Klasse IgG.

Immunglobuline sind aus jeweils zwei identischen schweren und zwei leichten Polypeptidketten aufgebaut, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die fünf Klassen von Immunglobulinen unterscheiden sich voneinander in den schweren Ketten (gamma, alpha, my, delta, epsilon). Unter den leichten Ketten werden zwei Typen (kappa, lambda) unterschieden.

Jede Polypeptidkette besteht aus einer variablen (V-) und einer konstanten (C-) Region. Die variablen Regionen weisen große Unterschiede in den Aminosäuresequenzen auf und sind für die Bindung des Antigen verantwortlich. Am Aufbau der Antigenbindungsstelle sind die variablen Regionen der schweren und leichten Kette beteiligt, wobei häufig nur wenige Aminosäuren die eigentliche Antigenbindung ermöglichen. Diese Orte innerhalb der V-Regionen unterscheiden sich deshalb besonders stark von einem Ig zum anderen und werden als hypervariable Regionen (complementarity determining regions, CDR) bezeichnet.

Durch Verdau mit den Proteasen Papain oder Pepsin kann das Ig in unterschiedliche funktionelle Einheiten zerlegt werden, die als Fab-Fragmente (fragment antibody) mit antigenbindender Funktion und Fc-Fragmente (fragment cristalline) mit komplementbindender Funktion bezeichnet werden.

Zur funktionellen Charakterisierung eines Immunglobulins sind hinsichtlich seiner spezifischen Wechselwirkung mit dem Antigen Kenntnisse über die Anzahl der Antigenbindungsstellen (die Valenz), die > Bindungsstärke des kompletten Ig-Moleküls an das Antigen (Avidität) und die Bindungsstärke einer einzelnen Haftstelle (Paratop) des Ig-Moleküls mit dem entsprechenden Epitop auf dem Antigen (Affinität) wichtig.

Herstellung von Antikörpern

Polyklonale Antikörper

Polyklonale Antikörper sind natürliche Gemische der Antikörper, die im Zuge der Immunreaktion gegen die verschiedenen Determinanten eines Antigens von den jeweiligen B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen gebildet werden. Zur Immunisierung sollte ein Antigen daher in möglichst reiner Form verabreicht werden. Am Anfang einer Immunreaktion dominieren Antikörper der Klasse IgM, später meist solche der Klasse IgG. Im Verlauf der Immunreaktion entstehen oft auch Antikörper höherer Affinität. Die verschiedenen Antikörpermoleküle differieren daher auch in ihren physikochemischen Eigenschaften, so daß die Qualität der Immunsera selbst eines Empfängers von Tag zu Tag erheblich variieren kann.

Das am häufigsten zur Erzeugung polyklonaler Antikörper genutzte Tier ist das Kaninchen. Geeignete Sera lassen sich jedoch auch von anderen Spezies wie Ziege, Schwein, Schaf, Pferd, Meerschweinchen u.a. gewinnen.

Jedes Tier besitzt allerdings eine Reihe spontan entstandener AK, die Störfaktoren bei der immunchemischen Reaktion darstellen können.

Der Nachteil polyklonaler AK besteht in der Hauptsache in ihrem breiten Reaktionsspektrum, welches zu Kreuzreaktionen führen kann (Kreuzreaktion bezeichnet die Bindung eines AK an verschiedene Antigene, die das gleiche oder ähnlich strukturierte Epitope haben).

Monoklonale Antikörper

Für die Produktion monoklonaler Antikörper werden Plasmazellen mit Zellen eines unbegrenzt teilungsfähigen Plasmazelltumors, eines Plasmozytoms fusioniert. Die resultierenden “Hybridome” haben Eigenschaften der Tumorzelle und des anderen Fusionspartnersproduzieren dauerhaft den bestimmten mAk, da sie sowohl Erbmaterial der Plasmazelle als auch der Myelomzelle enthalten. Die Poduktion der AK erfolgt entweder in der Zellkultur (AK im Medium) oder in Tieren (AK im Aszites).

Vorteile der monoklonalen AK sind

  • die Möglichkeit eines praktisch unbegrenzten Nachschubs,
  • die hohe Standardisierung,
  • die hohe und enge Spezifität.

Nachteile sind

  • z.T. eine zu enge Spezifität
  • eine teilweise geringe Stabilität.

Immunhistochemische Färbemethoden

Immunhistochemische Techniken werden angewandt, um antigene Komponenten in Zellen und Gewebsschnitten im mikroskopischen Bild nachzuweisen. Die geschieht mit spezifischen AK, die mit Fluoreszenzfarbstoffen, Enzymen, partikulärem Material (z.B. Goldpartikel) oder mit radioaktiven Isotopen markiert sind.

Wesentliche Voraussetzungen für die Aussagekraft der Methode sind die Spezifität der verwendeten AK und die Stabilität der nachzuweisenden antigenen Determinanten. Ein negativer Ausfall der Reaktion beweist daher nicht unbedingt das Fehlen des Antigens; in fraglichen Fällen sollte man mit optimal erhaltenem Gewebe (z.B. unfixierte Gefrierschnitte) arbeiten.

Die Gewebefixierung

Das Standardverfahren ist die Formalinfixierung (konzentriertes Formaldehyd 1 + 9 mit Wasser oder Puffer verdünnt), die eine relativ gute Durchdringung und Erhaltung des Gewebes ermöglicht. Durch Formalin werden die Proteine miteinander vernetzt und lösliche Antigene z.T. immobilisiert. Die Proteinvernetzung führt aber auch zur Maskierung oder Zerstörung antigener Strukturen.

Die Nachteile der Formalinfixierung lassen sich minimieren durch Verarbeitung kleiner Gewebeproben, die kurze Fixierungszeiten und eine gleichmäßige Durchtränkung des Gewebes mit der Fixierlösung ermöglichen. Das Formalin sollte weiterhin gepuffert sein.

Die Molekülvernetzungen lassen sich durch Andauen der Schnitte mit Pronase E (Gemisch verschiedener Proteasen), Protease oder Trypsin aufbrechen. Dabei spielen Andauzeit und Temperatur eine wichtige Rolle, da bei zu langen Einwirkzeiten die nachzuweisenden Antigene selbst aufgelöst werden.
Als Alternative zur Formalinfixierung bietet sich bei empfindlichen Antigenen die Gefriertechnik an. Ein schonendes und schnelles Einfrieren sind für eine gute Strukturerhaltung essentiell. In flüssigem Stickstoff vorgekühltes Isopentan dient als Kältevermittler. Das gefrorene Gewebe wird mit Gewebekleber (Tissue Tec) und CO2 aufgeblockt und im Kryostaten zwischen -10E C und -30E C geschnitten.

Der Gefrierschnitt wird am Objektträger angeschmolzen, getrocknet und unfixiert oder nach Fixierung mit Aceton weiterbearbeitet. Getrocknete Gefrierschnitte lassen sich längere Zeit bei -20E C oder besser bei -80E C aufbewahren, aufgeblockte Gewebsstücke lagert man bei -80E C. Mehrfaches Auftauen und Einfrieren schadet dem Gewebe und führt zu beträchtlichen Strukturveränderungen.

Markersubstanzen

Markersubstanzen dienen der Sichtbarmachung von gewebsgebundenen Antigen-Antikörperkomplexen. Folgende Substanzen finden Verwendung:

Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome) in Form von Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und Tetramethylrhodamin Isothiocyanat (TRITC) werden bevorzugt als Marker an Antikörper gekoppelt. Bei Anregung im UV-Licht oder bei Blau-Anregung mit entsprechenden Anregungs- und Sperrfiltern kommt es zu einer gelbgrünen (FITC) oder roten (TRITC) Fluoreszenz. Für die Intensität der spezifischen Fluoreszenz bei geringer unspezifischer Hintergrundfärbung ist ein optimales Fluoreszein-Protein (AK)-Verhältnis notwendig. Die Konjugation eines Fluorochroms mit einem AK über eine chemische Bindungsreaktion kann eventuell die AK-Struktur und damit die Immunreaktivität beeinflussen.

Der Vorteil der Fluoreszenzmethode liegt in ihrer schnellen und einfachen Durchführbarkeit.

Fluoreszenzfarbstoffe sind aber

  • relativ instabil (Ausbleichen) und
  • in vielen Fällen nur an Gefrierschnitten durchführbar.
  • Außerdem sind die Befunde häufig schlechter zu interpretieren und schwieriger bestimmten Gewebsstrukturen zuzuordnen.

Als Enzyme finden hauptsächlich Meerrettich-Peroxidase und alkalischer Phosphatase Verwendung. Hierbei wird ein farbloses Chromogen in ein farbiges Enzymprodukt umgewandelt.

Die Reaktion verläuft in 2 Schritten:

Enzym + Substrat = Enzym-Substratkomplex
Enzym-Substratkomplex – Enzym + Endprodukt

Enzyme können die 10.000 bis 1.000.000fache Menge an Substrat pro Minute umsetzen, so daß die Methode eine hohe Empfindlichkeit erreicht.

Die enzymatische Aktivität ist abhängig von

  • der Konzentration von Enzym und Substrat,
  • dem pH-Wert,
  • der Ionenkonzentration des Puffermilieus sowie
  • von der Temperatur und dem Lichteinfall.

Als AK-gekoppeltes Enzym ist Peroxidase aus einer Reihe von Gründen besonders geeignet:

  • Es ist klein und behindert nicht die Bindung des AK an das Antigen.
  • Es ist leicht erhältlich in hochgereinigter Form.
  • Es ist stabil und bleibt aktiv während der Kopplung an den AK sowie während der Lagerung und Anwendung.
  • Im Gewebe sind nur geringe Mengen von Peroxidase vorhanden, deren Aktivität sich leicht mit Methanol-H2O2 oder Puffer-H2O2-NaN3 unterdrücken läßt.
  • Es gibt etliche Chromogene, die mit Peroxidase Farbprodukte bilden und nach der Umsetzung präzipitieren.

Methoden

Die direkte Methode

Ein enzymmarkierter AK reagiert mit dem Gewebsantigen. Danach erfolgt die Substrat-Chromogenreaktion. Da nur eine AK-Inkubation notwendig ist, ist die Methode schnell durchführbar und es gibt kaum unspezifische Reaktionen. Allerdings ist die Methode relativ unempfindlich, da es keine weitere Signalverstärkung gibt. Die Methode wird heute kaum noch angewendet.

Die indirekte bzw. 2-Schritt-indirekte Methode

Ein unkonjugierter Primär-AK bindet an das Antigen. Anschließend wird ein 2. enzymgekoppelter AK, der gegen das Fc-Fragment des Primär-AK (jetzt als Antigen wirkend) gerichtet ist, aufgetragen. Es folgt die Substrat-Chromogenreaktion. Stammt der 1. AK aus Kaninchen oder Maus, muß der 2. AK gegen Kaninchen- bzw. Maus-Ig gerichtet sein. Das Verfahren ist flexibler als die direkte Methode, da eine Vielzahl von Primärantikörpern aus einer Spezies mit den gleichen markierten Zweit-AK kombiniert werden können. Die Methode ist um ein Vielfaches empfindlicher als die direkte Methode, da mehrere Zweit-AK (und somit mehrere Enzymmoleküle) an einen Primär-AK binden können (Signalverstärkung). Als unerwünschte Reaktion kann eine Kreuzreaktion der Zweit-AK mit endogenen Igs auftreten (wird durch Vorinkubation mit vorabsorbierenden Antiseren ausgeschaltet).

Die 3-Schritt-indirekte Methode

Zusätzlich zur 2-Schritt-indirekten-Methode folgt nach der Inkubation mit dem 1. enzymgekoppelten AK die Bindung eines 2. enzymgekoppelten AK, der gegen den 1. enzym- gekoppelten AK gerichtet ist. Sekundär- und Tertiär-AK sind mit dem gleichen Enzym gekoppelt. Bei der 3-Schritt- indirekten Methode ist durch die größere Anzahl der Enzymmoleküle die Empfindlichkeit gegenüber der 2- Schritt-Methode nochmals gesteigert; die Sensitivität ist vergleichbar mit der Verwendung von löslichen Immun komplexen oder der Avidin-Biotin-Methode.

Das Verfahren der löslichen Enzym-Immunkomplexe

Die Methode wird auch als unmarkierte Antikörpertechnik (unlabelled antibody method) bezeichnet, nützt die präformierten löslichen Enzym-anti-Enzym-Immunkomplexe aus Antigen (= Enzym) und den dagegen gerichteten AK. Um einen löslichen Enzym-anti-Enzymkomplex zu erhalten, wird das Enzym im Überschuß zugeführt und die entsprechenden Präzipitate entfernt. Nacheinander werden unkonjugierte Primärantikörper – unkonjugierte Sekundärantikörper – lösliche Enzym-anti-Enzymkomplexe – Substratlösung aufgetragen . Der Primärantikörper und der AK des Enzym-Immunkomplexes stammen aus derselben Spezies, so daß der Sekundärantikörper (auch Brücken-AK genannt) diese beiden verbinden kann. Der Sekundär-AK muß also gegen Igs der Spezies gerichtet sein, aus der Primär-AK und die im Enzym-Immunkomplex befindlichen AK stammen. Außerdem muß der Zweit-AK im Überschuß vorliegen, so daß eine der beiden antigenbindenden Regionen an den Primär-AK bindet und der andere antigenbindende Arm zur Anlagerung des Enzym-Immunkomplexes verfügbar bleibt.

Die Methoden werden nach dem jeweils verwendeten Enzym-Immunkomplex benannt:

Die PAP-Methode

Immunkomplexe aus Peroxidase und anti-Peroxidase bestehen aus 3 Peroxidasemolekülen und 2 AK gegen das Enzym.

Die APAAP-Methode

Die Immunkomplexe bestehen aus alkalischer Phosphatase und anti-Alkalischer Phosphatase AK.

Je 2 Moleküle Enzym sind an einen AK gebunden. Enzym-Immunkomplex-Methoden gehören zu den empfindlichsten immunhistochemischen Techniken. Sie nutzen die natürliche Affinität von AK gegenüber ihrem Antigen durch Einsatz stabiler Immunkomplexe anstelle der relativ unsanften chemischen Konjugation. Sie zeigen eine bessere Sensitivität gegenüber anderen Methoden hauptsächlich durch die größere Anzahl an Enzymmolekülen, die pro Gewebsantigen zur Verfügung stehen

Die Avidin-Biotin-Methoden

Die Avidin-Biotin-Methode bzw. Streptavidin-Biotin-Methode nutzt die starke Affinität von Avidin oder Streptavidin für Biotin zur Bildung von Komplexen aus enzymmarkierten Avidin-Biotin-Komplexen mit biotinylierten Sekundär-AK (ABC-Methode) oder zur Kopplung enzymmarkierten Avidins an biotinylierte Sekundär-AK (labelled avidin biotin technique, LAB). In beiden Fällen ist also ein biotinylierter 2.AK notwendig, wobei das Biotin kovalent an den AK gebunden ist. Bei der Reaktion bindet das Avidin der A-B-Komplexe oder enzymgekoppeltes Avidin allein an den Sekundär-AK. Die Reihenfolge der Applikation ist Primär-AK – biotinylierter Zweit-AK – vorgeformte Avidin-Biotin-Enzymkomplexe oder enzymmarkiertes Avidin – Substratlösung. Als Enzym wird am häufigsten Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase verwendet. Die ABC- und die LAB-Technik haben die höchste Sensitivität im Vergleich zu den bisher erwähnten Methoden.

EPOS

Tyramin-Verstärkung

Die verwendeten Grafiken wurden freundlicherweise von Herrn Dr. C. Henne, Fa. DAKO, Hamburg, zur Verfügung gestellt.

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