Histologische Technik

1. Fixierung

Unmittelbar nach der Entnahme setzt in Gewebsproben die Autolyse bzw. Heterolyse ein. Das Gewebe muß daher sofort frisch bearbeitet oder aber fixiert werden. Durch die Fixation wird die Zersetzung aufgehalten.

Das am weitesten verbreitete Fixierungsmittel ist das Formalin. Dabei handelt es sich um eine verdünnte und gepufferte Formaldehyd-Lösung. Formalin vernetzt Proteine und verleiht dem Gewebe eine gummiartige Konsistenz.

Die Formalinfixierung hat jedoch auch Nachteile. Die meisten Proteine verlieren durch die Fixierung ihre Funktion und einen großen Teil ihrer antigenen Eigenschaften. Viele enzymhistochemische und immunhistologische Untersuchungen können daher nicht an Formalin-fixiertem Material durchgeführt werden. Da es sich bei Formalin um eine wässrige Lösung handelt, werden Glykogen und viele andere Polysaccharide sowie bestimmte Kristalle wie etwa Urate herausgelöst. Für spezielle Fragestellungen verwendet man daher andere Fixantien, z.B. Alkohol. Für elektronenmikroskopische Untersuchungen wird oft Glutaraldhyd verwendet. Im Zweifelsfall sollte man sich bei besonderen Fragestellungen vor der Probengewinnung bei dem Pathologen, den man mit dem Material zu überraschen gedenkt, erkundigen!

Für alle Fixierungsmittel gilt, daß die Dauer der Fixierung von der Größe der Gewebsprobe abhängt und daß das Fixans in mindestens 20-fachem Volumenüberschuß vorliegen soll. Das Gewebe muß im Fixierungsmittel schwimmen! Ist die Größe des Untersuchungsmaterials nicht durch die Entnahme bereits festgelegt (z.B. Punktionszylinder), so muß das Präparat zur besseren Fixierung angeschnitten werden, ohne dabei die Zusammenhänge zu zerstören. So sollen z.B. Hohlorgane aufgeschnitten werden (außerhalb z.B. des Ulkus, des Tumors oder einer anderen zu untersuchenden Läsion!), damit die leicht verderbliche Schleimhaut vom Fixierungsmittel erreicht wird. Parenchymatöse Organe sollen angeschnitten (Leber, Milz) oder durchspült werden (Lunge). Messer und Scheren müssen scharf sein, um Quetschartefakte zu vermeiden.

Der beste Weg ist jedoch, wenn immer möglich, das Untersuchungsgut der Pathologie frisch und unfixiert (am besten eisgekühlt in physiologischer Kochsalzlösung) zur Bearbeitung zu übergeben. Damit ist gewährleistet, daß auch alle erforderlichen Untersuchungsmethoden angewendet werden können und ggf. frisches Gewebe asserviert werden kann. So können intraoperative Schnellschnitte nur von Frischgewebe angefertigt werden. Von frischem Material lassen sich z.B. auch Tupfpräparate für die zytologische Dagnostik gewinnen. Viele enzymhistochemische Tests sind nur am frischen Gewebe durchführbar. In der Immunhistologie steht für Kryostatschnitte eine viel breitere Palette von Antikörpern als für fixiertes Gewebe zur Verfügung. Ferner kann man vom frischen Gewebe hochmolekulare Nukleinsäuren (DNA, RNA) für die molekular-pathologische Diagnostik gewinnen. Bei Bedarf kann Gewebe für eine mikrobiologische Diagnostik weitergeleitet werden. Außerdem können z.B. Organpräparate fachgerecht aufgeschnitten und auf Korkplatten aufgesteckt fixiert werden.

2. Zuschnitt

Gewebsproben, die größer als die Einbettkassetten sind, müssen fachgerecht zugeschnitten werden. Dieses gilt insbesondere für Operationspräparate mit Tumoren, bei denen verschiedene Anteile des Tumors zur Ausbreitungsdiagnostik, die Abtragungsebenen (tumorfrei?) und regionäre Lymphknoten (Metastasen?) histologisch untersucht werden müssen. Mit dem Zuschnitt ist die makroskopische Beschreibung einschließlich einer orientierenden Dagnostik nach den Grundzügen der pathologischen Anatomie verbunden. Das zugeschnittene Gewebe wird in siebartige Plastikkassetten, die mit der Fallnummer bedruckt werden, gelegt und gelangt dann zur weiteren Fixierung oder ggf. auch zur Entkalkung (Knochengewebe usw.). Danach wird das Fixierungsmittel ausgewaschen, da es die weiteren Schritte stören kann.

3. Einbettung

Um dünne und gleichmäßige Schnitte herstellen zu können, muß das Material Stabilität und eine gleichmäßige Konsistenz aufweisen. Dafür tränkt man das Gewebe in heißem Paraffinwachs, das bei Abkühlung erstarrt. Da Paraffin nicht wasserlöslich ist, muß das Gewebe in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert werden. Anschließend wird der Alkohol durch ein Intermedium (z.B. Xylol) entfernt und dann das Xylol durch heißes Paraffinwachs ersetzt. Die von Paraffin durchtränkten Gewebestücke werden dann in ein Gießschälchen gelegt, mit heißem Paraffin überschichtet und zu einem Paraffinblock verabeitet, wobei die Einbettkassette (mit der Fallnummer) den Blockträger bildet.

Das Gewebe wird derart angeordnet, daß die zu schneidende Fläche auf dem Boden liegt. Nach Erkalten des Paraffins wird der Block aus der Gießform geschlagen.

Für unentkalkte Hartgewebe (Zähne, Knochen) verwendet man anstelle des Paraffins Acryl-Kunstharze, die auch ohne Entkalkung die Herstellung von Schnitt- oder Feinschliff-Präparaten erlauben.

4. Herstellung von Paraffin-Schnittpräparaten

Gewebsschnitte von einigen Mikrometern Dicke lassen sich nur mit Spezialapparaten herstellen. Zum Anfertigen von Paraffinschnitten werden Rotations- oder ein Schlittenmikrotome verwendet. Diese bestehen aus einer Haltevorrichtung, in die das Blöckchen eingespannt wird, einem Messer und einer Mechanik zur Steuerung der Schnittdicke. Der Block wird bis unmittelbar unter die Schnittebene des ebenfalls fest eingeschraubten Messers gebracht. Danach beginnt man die gewünschten Schnitte von 4 bis 7 Mikrometer Dicke zu schneiden. Der Schnitt schiebt sich dabei auf das Messer. Von dort wird er mit einem angefeuchteten Pinsel abgehoben und in ein Warmwasserbad übertragen. Hierdurch wird der Schnitt gestreckt und von Falten befreit. Dann werden die Schnitte auf saubere und fettfreie Objektträger aufgezogen. Dazu werden diese so tief und schräg in das Wasserbad gehalten, daß der Schnitt an der gewünschten Stelle aufgezogen werden kann. Die Objektträger werden je nach Färbungen in Küvetten sortiert und bis zum Färben in einem 37 Grad C warmen Brutschrank zum Trocknen und zur besseren Haftung aufbewahrt.

5. Herstellung von Schnellschnitten / Gefrierschnitten

Unfixiertes Gewebe kann durch Einfrieren gehärtet und damit schneidbar gemacht werden. Diese Methode wird angewandt, wenn Wert auf eine schnelle (z.B. intraoperative) Diagnose gelegt wird. Allerdings führt das Einfrieren und die vermehrte mechanische Beanspruchung des unfixierten Gewebes häufiger zu Artefakten. Zudem besteht eine erhöhte Infektionsgefahr bei der Bearbeitung von unfixierten Gewebsproben. Besonders geeignet ist die Gefriermethode zur Herstellung von Schnitten, in denen Fett dargestellt werden soll, da hier die Anwendung fettlösender Mittel wegfällt, und zur Herstellung von enzymhistochemischen und immunhistologischen Färbungen.

6. Färbung

Nach dem Schneiden und Trockenen im Brutschrank werden die Schnitte in Xylol entparaffiniert, durch die absteigende Alkoholreihe wieder in ein wässriges Milieu überführt und schließlich in den jeweiligen Färbelösungen gefärbt. Je nach Färbung läßt man die Schnitte sofort trocknen oder bringt sie durch die aufsteigende Alkoholreihe bis ins Xylol und deckt sie dann ein.

6.1 Physikalische Färbungen

Farbstoffaufnahme durch Löslichkeit in Strukturbestandteilen: Bei der Fettfärbung z.B. lösen sich die angebotenen Farbstoffe leichter in den Gewebslipiden als in der angebotenen alkoholischen Lösung. Sie diffundieren aus der Farblösung in den von ihnen bevorzugten Anteil des Präparates. Durchtränkungsverfahren: Hierbei wird die dichteste Struktur am stärksten gefärbt, weil die Zahl der Strukturlücken, die den Farbstoff aufnehmen können, größer ist als in lockeren Strukturen. Grob disperse Stoffe benötigen lang, um in enge Maschen zu gelangen.

6.2 Physikochemische Vorgänge bei Färbungen

Elektroadsorption: Grundlage ist der amphotere Charakter des Eiweißes. Ist der pH höher als der isoelektrische Punkt, hat die Struktur saure Gruppen und neigt zur Salzbildung mit basischen Farbstoffen – und umgekehrt. Den unterschiedlichen isoelektrischen Punkt (I.P.) von Zellkern und Plasma nutzt man für eine Endpunktfärbung (= unabhängig von der Färbedauer) aus: liegt ein basischer Farbstoff in saurer Lösung bei einem pH vor, der zwischen dem I.P. der Kerne (etwa 3,8) und dem des Plasmas (etwa 6,5) bei 4,5 eingestellt ist, so werden elektiv nur die Zellkerne gefärbt, denn nur sie haben dann noch negative Ladung.

6.3 Chemische Färbungen

Die Reaktion zwischen Farbstoff und Substrat verläuft nach den Gesetzmäßigkeiten chemischer Bindungen. Sie gewähren also einen Stoffnachweis im chemischen Sinne. Ist der fragliche Stoff nicht vorhanden, fällt die Reaktion negativ aus (z.B. Eisennachweis).

6.4 Beispiele für Färbungen (siehe auch: Färbemethoden)

  • HE (Hämatoxilin-Eosin): ist die gebräuchlichste Färbung. Sie gibt eine gute Übersicht. Sie beruht auf dem Prinzip der Elektroadsorption. Kerne: blau, Cytoplasma: rot.
  • van Gieson: Färbung der Kerne mit Weigerts Eisenhämatoxylin – Cytoplasma wird mit van Gieson-Gemisch gefärbt (Pikrinsäurelösung und Säurefuchsin). Sie ist ein Beispiel für das Durchtränkungsverfahren. Ergebnis: Kerne schwarz, Bindegewebe rot, Muskulatur und Cytoplasma gelb, Neuroglia gelblich, bemarkte Nervenfasern grau, Schleim gelb bis rot.
  • PAS (= Perjodsäure-Schiff Reaktion): Beruht auf der Darstellung von zwei dichtgelagerten Aldehydgruppen mit Hilfe der fuchsinschwefeligen Säure. Perjodsäure hydrolysiert zuvor Kohlehydrate zu Aldehydgruppen. Ergebnis: Kohlehydrate purpur, Kerne blau, auch Cerebroside, Ganglioside, Mukoproteide und Glykoproteide geben eine positive Reaktion.
  • Versilberung: Silbersalze werden durch starke Laugen in Silberoxyd umgewandelt, das dann als schwarzer Niederschlag ausfällt. Durch Zugabe von Ammoniak entsteht Diaminsilberoxyd, das sich durch Formalin reduzieren läßt. Dabei entsteht metallisches Silber als Niederschlag, Ammoniak und Ameisensäure. Versilberungen bringen verschiedene Feinstrukturen zur Darstellung, z.B. retikuläre Bindegewebsfasern, Zellgrenzen von Deckepithelien, Mikroorganismen, neurale Strukturen.

7. Einschluß

Zur mikroskopischen Untersuchung und zur Konservierung des Schnitts werden die gefärbten Präparate mit einem Tropfen eines Einschlußmediums gebracht und mit einem Deckglas versehen. Dieses soll die Präparate durchsichtig erhalten und gleichzeitig ihre Strukturen und Färbungen nicht schädigen. Es werden je nach Art der Färbung wässrige, wasserfreie und fluoreszenzfreie Einschlußmedien verwendet. Beim Einschließen wird ein geeignet großer Tropfen des Mediums mit einem Glasstab entweder direkt auf den Schnitt oder auf das Deckglas gebracht. Dann wird das Deckglas aufgelegt. Anschließend werden Luftbläschen und überquellendes Medium entfernt. Dieser Vorgang kann auch mit Hilfe von Eindeckmaschinen automatisert durchgeführt werden.

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